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Como é realizada a centrifugação por gradiente de densidade?

A centrifugação é o processo utilizado para separar partículas de diferentes densidades, através da força centrífuga. Dessa forma, é possível separar diversos elementos de uma mistura, seja líquido-líquido ou líquido-sólido.

Quando uma amostra é colocada em uma centrífuga e a força é aplicada, elementos de maior densidade se movem em direção ao fundo do recipiente, enquanto os de menor densidade ficam próximos a superfície.

Vamos tomar o exemplo de um recipiente com areia e água. Ao serem misturados e depois deixados em repouso, percebemos que a areia sedimenta rapidamente para o fundo, devido à influência da gravidade.

No entanto, para as macromoléculas (como DNA e proteínas) essa sedimentação não é perceptível e se mantém distribuída na solução. Mas, quando são aplicadas altas acelerações, o comportamento de sedimentação das macromoléculas irá lembrar aquele dos grãos de areia.

Assim, a aceleração centrífuga ocasiona o aumento do efeito da sedimentação pela gravidade. Por essa razão, a centrifugação é tão utilizada nos processos laboratoriais para separação de misturas e purificação de partículas biológicas.

Centrífugas: princípios básicos da técnica de centrifugação

Tipos de separação por centrifugação

A obtenção de amostras adequadas para a fase analítica requer vários processos de separação que irão basear-se nas propriedades e tipos celulares presentes. As etapas de centrifugação com diferentes velocidades permitem obter diferentes frações de células ou tecidos. A centrifugação por gradiente de densidade é o método que melhora muito a eficiência da separação.

Existem dois tipos de técnicas centrífugas para separação de partículas, centrifugação diferencial e centrifugação por gradiente de densidade.

A centrifugação por gradiente de densidade pode ainda ser dividida em centrifugação zonal e isopícnica.

 

Centrifugação diferencial

Na centrifugação diferencial a separação é baseada no tamanho das partículas. Uma suspensão contendo diferentes moléculas é centrifugada e as partículas maiores sedimentam com mais rapidez do que as partículas menores. Dessa forma, partículas com densidades e tamanho diferentes sedimentarão em taxas diferentes.

São realizadas sucessivas centrifugações em velocidade crescente. Em cada etapa, apenas duas frações são formadas: o sedimento ou pellet (o que permanece compactado no fundo) e o sobrenadante. A primeira centrifugação tem velocidade mais lenta e o pellet é formado pelas partículas maiores. A centrifugação subsequente com uma força centrífuga mais alta granulará partículas com um tamanho inferior e assim por diante.

Por exemplo, na amostra centrifugada a 1.000 x g por 10 minutos, células intactas e núcleos densos formam o pellet. O sobrenadante pode ser centrifugado novamente a 10.000 x g por 20 minutos e terá pellet formado por mitocôndrias e lisossomos.

 

Exemplos de aplicação

Peletização de células e bactérias de um meio em crescimento, coleta de DNA precipitado.

 

Centrifugação diferencial

Centrifugação diferencial

 

Centrifugação por gradiente de densidade

Na centrifugação por gradiente, as partículas sob força centrífuga se depositam através do gradiente, concentrando-se em zonas ou bandas.

O gradiente de densidade é criado por concentrações crescentes de uma substância adequada para o experimento (como sacarose ou cloreto de césio), formando assim um gradiente de concentração.

Esse tipo de centrifugação é útil para purificar partículas, como organelas ou macromoléculas. São subdivididas ainda em dois tipos: escala zonal (tamanho) e isopícnica (densidade).

 

Gradiente de densidade de Escala Zonal

A centrifugação por gradiente de densidade de escala zonal separa partículas que possuem densidades similares e massas diferentes.

O gradiente estabiliza as bandas e fornece um meio de densidade e viscosidade crescentes. Sua finalidade é permitir a passagem suave pelas várias zonas, diminuindo a mistura das soluções. A amostra é colocada cuidadosamente no topo do tubo com o gradiente de densidade.

Durante a centrifugação, cada partícula sedimenta com uma velocidade que depende principalmente da sua massa e tamanho. As zonas são formadas por partículas de tamanhos semelhantes, conforme as partículas de sedimentação mais rápida se movem frente às mais lentas. No final, as partículas separadas em zonas são coletadas.

O tempo interfere muito nesse processo, a centrifugação deve ser interrompida assim que as partículas forem separadas, ou seja, antes que atinjam o fundo do tubo.

 

Exemplos de aplicação

Isolamento de subunidades ribossomais em um gradiente de sacarose.

Centrifugação por gradiente de densidade de Escala Zonal

Centrifugação por gradiente de densidade de Escala Zonal

Gradiente de densidade Isopícnica ou de Equilíbrio

A centrifugação por gradiente de densidade isopícnica (do grego “isos” igual e “pyknos” denso, ou seja, de igual densidade) separa partículas de tamanhos semelhantes, porém com densidades diferentes.

A amostra é misturada em uma solução com gradiente de densidade conhecido, igual a densidade média das partículas. A solução é submetida à centrifugação até que a solução chegue ao equilíbrio, ou seja, no ponto em que as densidades são iguais. Cada partícula migra para a posição em que o gradiente de densidade é igual a ela, formando assim as bandas nesses locais.

O tempo de centrifugação não interfere nesse processo, uma vez que quanto a partícula atinge seu ponto de equilíbrio permanece nessa região, não sedimentando para o fundo do tubo.

Exemplos de aplicação

Separação de ácidos nucleicos em gradiente de cloreto de césio (CsCl).

Centrifugação por gradiente de densidade Isopícnica ou de Equilíbrio

Centrifugação por gradiente de densidade Isopícnica ou de Equilíbrio

 

 

 

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Referências

  • BRUNO, Alessandra Nejar. Biotecnologia I. ArtMed, 2014.
  • Karp, Gerald Biologia celular e molecular. 3ª edição. Manole, 2005.
  • VOET, Donald, VOET, Judith G. Bioquímica, 4ª edição. ArtMed, 2013. 
  • BARKER, Kathy. Na bancada: manual de iniciação científica em laboratórios de pesquisas biomédicas. Porto Alegre: Artmed, 2002.