Eletroforese: guia completo para escolher o sistema ideal para o seu laboratório

A eletroforese é uma das técnicas mais utilizadas em laboratórios de biologia molecular, genética, microbiologia e bioquímica. Presente nas rotinas de pesquisa, ela permite separar e analisar moléculas com base em características como tamanho, carga elétrica e conformação.

Apesar de o princípio da técnica ser relativamente simples, obter resultados consistentes depende de uma série de fatores. A escolha dos equipamentos e insumos pode influenciar diretamente a qualidade das bandas e a interpretação dos resultados.

Por isso, montar um sistema de eletroforese não significa apenas escolher um equipamento. É necessário pensar no fluxo de trabalho como um todo, desde o preparo das amostras até a visualização final do gel.

O que é eletroforese e como a técnica funciona?

É uma técnica de separação de moléculas carregadas por meio da aplicação de um campo elétrico. Quando submetidas a uma diferença de potencial, as moléculas migram através de uma matriz, geralmente um gel, em direção ao polo de carga oposta.

No caso dos ácidos nucleicos, como DNA e RNA, a presença dos grupos fosfato confere carga negativa às moléculas. Assim, quando submetidos ao campo elétrico, esses fragmentos migram em direção ao polo positivo.

A matriz utilizada durante a corrida funciona como uma espécie de peneira molecular. Fragmentos menores encontram menos resistência para atravessar os poros do gel e, em condições adequadas, migram mais rapidamente do que fragmentos maiores. Ao final da corrida, essa diferença de migração permite observar bandas correspondentes a fragmentos de diferentes tamanhos.

De forma geral, uma rotina de eletroforese em gel envolve as seguintes etapas:

1. preparo do gel;
2. formação dos poços para aplicação das amostras;
3. preparo e pipetagem das amostras;
4. aplicação do marcador de peso molecular;
5. realização da corrida eletroforética;
6. coloração ou detecção dos ácidos nucleicos;
7. visualização e análise das bandas.

Cada uma dessas etapas depende da escolha adequada de equipamentos, reagentes e acessórios.

Quais são as principais aplicações da eletroforese?

Na biologia molecular, a técnica é amplamente utilizada para avaliar produtos de PCR, analisar fragmentos de DNA, verificar a integridade de ácidos nucleicos e acompanhar diferentes etapas de protocolos experimentais.

 Na microbiologia, a eletroforese pode integrar fluxos de trabalho voltados à pesquisa e identificação molecular de microrganismos. Já na bioquímica, diferentes formatos da técnica podem ser empregados na análise de proteínas e outras biomoléculas.

Essa versatilidade faz com que existam diferentes configurações de sistemas de eletroforese. A escolha ideal depende principalmente do tipo de molécula analisada, do tamanho dos fragmentos, da quantidade de amostras e dos objetivos do experimento.

Como escolher um sistema de eletroforese?

Antes de adquirir os componentes, é importante analisar a rotina do laboratório. Um sistema adequado deve oferecer compatibilidade entre seus diferentes elementos e atender ao volume e ao tipo de análise realizada.

A seguir, confira os principais pontos que devem ser considerados.

1. Comece pela aplicação: o que será analisado?

A primeira pergunta é: qual será a principal aplicação da eletroforese?

Para análises rotineiras de DNA e RNA, especialmente de fragmentos provenientes de PCR, a eletroforese horizontal em gel de agarose é uma das configurações mais utilizadas. Já para a separação e análise de proteínas, são comumente empregados sistemas de eletroforese vertical com gel de poliacrilamida, como nas técnicas PAGE e SDS-PAGE.

O tipo e o tamanho das moléculas analisadas influenciam diretamente a escolha do sistema, da matriz e das condições da corrida. Na eletroforese de ácidos nucleicos, por exemplo, o tamanho dos fragmentos deve ser considerado na definição da concentração do gel de agarose. Para proteínas, fatores como tamanho, carga e conformação podem determinar a técnica e as condições experimentais mais adequadas.

Por isso, antes de escolher os equipamentos e consumíveis, é fundamental definir o tipo de amostra, o objetivo da análise e o volume de trabalho do laboratório.

2. Cuba de eletroforese: onde a separação acontece

A cuba de eletroforese é um dos principais componentes do sistema. É nela que o gel é posicionado e submerso no tampão de corrida para que a migração das moléculas ocorra.

Para escolher a cuba, considere aspectos como:

• dimensões do gel;
• número de amostras processadas por corrida;
• compatibilidade com bandejas e pentes;
• volume de tampão necessário;
• tipo de aplicação realizada.

Cubas maiores podem permitir o processamento de um número maior de amostras simultaneamente, enquanto modelos compactos podem ser mais adequados para rotinas com menor demanda.

Outro ponto importante é verificar os acessórios compatíveis com a cuba. Bandejas, pentes e outros componentes precisam apresentar dimensões adequadas para garantir a correta formação do gel e dos poços.

3. Fonte de eletroforese: controle das condições da corrida

Se a cuba é o ambiente onde ocorre a separação, a fonte de eletroforese é responsável por fornecer a energia elétrica necessária para a migração das moléculas.

A escolha da fonte deve considerar parâmetros como:

• faixa de tensão;
• corrente;
• potência;
• possibilidade de ajuste dos parâmetros;
• compatibilidade com a cuba;
• número de sistemas que podem ser conectados.

A voltagem aplicada influencia diretamente a velocidade de migração. Entretanto, utilizar uma tensão excessivamente elevada não significa necessariamente obter resultados mais rápidos e melhores. Condições inadequadas podem aumentar o aquecimento do sistema e prejudicar a resolução das bandas.

Por isso, a fonte deve permitir o controle adequado das condições experimentais de acordo com o protocolo utilizado.

Ao montar um sistema, é essencial avaliar a compatibilidade entre cuba e fonte de eletroforese. Esses dois equipamentos trabalham em conjunto e precisam atender às exigências da aplicação.

4. Pente para cuba: um acessório que influencia a capacidade do gel

O pente para cuba de eletroforese é utilizado durante o preparo do gel para formar os poços nos quais as amostras serão aplicadas.

Embora pareça um componente simples, sua escolha influencia diretamente a organização do experimento. O número e o tamanho dos dentes determinam:

• quantas amostras podem ser aplicadas;
• o volume aproximado comportado por cada poço;
• a disposição das amostras no gel.

Por isso, é importante escolher um pente compatível com a cuba e com a bandeja utilizadas.

Para experimentos com poucas amostras e maior volume por poço, uma configuração pode ser mais adequada. Já rotinas com muitas amostras podem exigir pentes com maior número de dentes.

Antes de iniciar o preparo do gel, também é importante verificar se o pente está corretamente posicionado. A remoção deve ser cuidadosa para preservar a integridade dos poços.

5. Agarose: a matriz de separação

Na eletroforese de ácidos nucleicos, a agarose é um dos materiais mais importantes. Esse polissacarídeo forma uma matriz porosa que permite a separação das moléculas durante a corrida.

A concentração de agarose influencia diretamente o tamanho dos poros do gel. De maneira geral, concentrações mais baixas formam poros maiores e podem ser mais adequadas para a separação de fragmentos maiores. Já concentrações mais elevadas resultam em poros menores, favorecendo a resolução de fragmentos menores.

Por isso, não existe uma única concentração ideal para todas as aplicações.

A escolha deve considerar principalmente:

• faixa de tamanho dos fragmentos;
• resolução desejada;
• tipo de amostra;
• protocolo utilizado.

A qualidade da agarose também é um fator importante para a formação de um gel uniforme e para a obtenção de resultados reprodutíveis.

Durante o preparo, a agarose é adicionada ao tampão e aquecida até sua completa dissolução. Após o resfriamento e a polimerização, forma-se a matriz na qual as amostras serão aplicadas.

6. Marcador de peso molecular: a referência para interpretar as bandas

Observar bandas no gel não é suficiente: é necessário ter uma referência para estimar o tamanho dos fragmentos analisados.

Essa é a função do marcador de peso molecular, também conhecido como DNA ladder em aplicações com DNA.

O marcador é composto por fragmentos de tamanhos conhecidos. Durante a eletroforese, ele migra pelo gel juntamente com as amostras, formando um padrão de bandas que pode ser utilizado como referência.

Para escolher o marcador adequado, considere:

• faixa de tamanho dos fragmentos de interesse;
• distribuição das bandas do marcador;
• aplicação experimental;
• compatibilidade com o sistema de detecção.

Se o objetivo é analisar fragmentos pequenos, o marcador deve apresentar uma faixa que permita diferenciá-los adequadamente. O mesmo raciocínio vale para fragmentos maiores.

Portanto, o melhor marcador não é necessariamente aquele com a maior faixa possível, mas aquele que oferece referências adequadas à região de interesse do experimento.

7. Corante não mutagênico: visualização com mais segurança na rotina

Após a separação, os ácidos nucleicos precisam ser detectados para que as bandas sejam visualizadas.

Durante muitos anos, o brometo de etídio foi amplamente utilizado para essa finalidade. Entretanto, devido aos riscos associados à sua manipulação, muitos laboratórios passaram a buscar alternativas para a coloração dos ácidos nucleicos.

Os corantes não mutagênicos, como o Corante Safer Kasvi, representam uma alternativa para a visualização das bandas em gel de agarose.

Na escolha do corante, é importante verificar:

• compatibilidade com DNA ou RNA;
• sensibilidade;
• forma de aplicação;
• compatibilidade com a fonte de iluminação;
• requisitos de segurança e descarte.

A escolha do corante também deve estar relacionada ao sistema de visualização. Um corante compatível com iluminação LED, por exemplo, pode permitir a adoção de um fluxo de análise sem exposição direta do gel à radiação UV.

8. Transiluminador: a etapa de visualização das bandas

Após a corrida, chega o momento de visualizar o resultado. O transiluminador fornece a fonte de iluminação necessária para detectar a fluorescência do corante associado aos ácidos nucleicos.

Entre as tecnologias disponíveis estão os sistemas baseados em luz UV e LED.

Na escolha do transiluminador, avalie:

• compatibilidade com o corante utilizado;
• tamanho da área de visualização;
• tipo de iluminação;
• aplicação do laboratório;
• necessidade de manipulação ou recuperação posterior das bandas.

Assim, o sistema de visualização deve ser escolhido em conjunto com o corante. Essa compatibilidade é fundamental para que as bandas possam ser detectadas adequadamente.

9. Micropipetas e ponteiras: precisão começa antes da corrida

Uma boa separação eletroforética depende também da qualidade do preparo e da aplicação das amostras.

Volumes incorretos, variações entre pipetagens ou aplicação inadequada nos poços podem comprometer a comparação entre amostras e até mesmo danificar o gel.

Por isso, micropipetas e ponteiras são componentes essenciais da rotina.

A micropipeta deve apresentar faixa de volume compatível com os volumes utilizados no protocolo. Para a aplicação das amostras no gel, é importante trabalhar com controle e precisão, evitando perfurar o fundo do poço ou liberar a amostra fora da posição adequada.

As ponteiras também devem apresentar encaixe adequado à micropipeta. Dependendo da aplicação, podem ser utilizadas opções de baixa retenção ou com filtro.

Erros comuns que podem comprometer a eletroforese

Mesmo com equipamentos adequados, alguns erros experimentais podem prejudicar o resultado.

Entre os problemas mais frequentes estão a escolha inadequada da concentração de agarose, o preparo incorreto do tampão, a aplicação de volumes incompatíveis com os poços, o uso de condições inadequadas de voltagem e a seleção de um marcador que não cobre a faixa de interesse.

Outros fatores incluem a formação de bolhas no gel, danos aos poços durante a retirada do pente e erros durante a pipetagem das amostras.

Também é importante verificar a orientação da cuba antes de iniciar a corrida. Como os ácidos nucleicos apresentam carga negativa, eles devem migrar em direção ao polo positivo. Uma montagem incorreta pode fazer com que as amostras migrem na direção oposta à esperada.