Como é realizada a Contagem de Células?
Princípio da Câmara de Contagem
A câmara de contagem, também conhecida como câmara de Neubauer, Fuchs Rosenthal ou ainda hemocitômetro, foi desenvolvida originalmente para determinar a concentração de células sanguíneas (por isso o prefixo “hemo”).
Hoje mantém o mesmo objetivo, determinar o número de células em um volume específico de solução, porém tornou-se mais abrangente e possui várias aplicações biológicas. Além de células sanguíneas, é utilizada ainda em microbiologia, contagem de células suspensas, espermatozoides, urinálise, entre outros.
As câmaras de contagem são dispositivos que consistem geralmente em uma lâmina grossa de uso microscópico com uma profundidade específica para depósito da amostra. Seu centro é formado por duas câmaras nas quais são gravadas linhas divididas em quadrantes de dimensões conhecidas, chamadas de malhas de leitura.
Como há a padronização destes quadrantes é possível visualizar a amostra ao microscópio e assim realizar a contagem determinando o número de células presentes naquela área determinada.
Existem muitos tipos de câmaras de contagem disponíveis. Elas são diferenciadas por algumas características como a profundidade da câmara, resolução (área mm²), material (vidro ou descartável) e o desenho da malha (Neubauer / Fuchs Rosenthal).
Desenho da malha
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Preparação da amostra para a câmara de contagem
O líquido contendo as células deve ser preparado adequadamente antes de ser aplicado à câmara de contagem.
O fluído deve ser uma suspensão homogênea e ter a concentração apropriada. Se for muito alta as células se sobrepõem dificultando a contagem. Já uma concentração baixa, o resultado por quadrante pode levar a um erro estatístico, além de serem necessários mais quadrantes para contagem, o que demanda mais tempo.
Depois de diluída, a amostra deve ser cuidadosamente introduzida no espaço entre a lâmina e a câmara de Neubauer, preenchendo-a completamente por capilaridade.
Amostra aplicada à Câmara de Neubauer
Contagem de células
A câmara de contagem é levada ao microscópio, permitindo a visualização da malha e dos quadrantes. As marcações dos quadrantes têm dimensões distintas, permitindo que sejam realizadas contagens de células de tamanhos diferentes, grandes ou pequenas.
É muito fácil se perder nessa contagem. Laboratórios podem ter técnicas diferentes, mas algumas regras são bem populares, como realizar a contagem em zique-zague e também a contagem para as células que dividem dois quadrantes.
Contagem em zigue-zague
As células que dividem dois quadrantes devem ser contadas uma única vez. Assim, as células que tocam na parte superior e esquerda dos limites devem ser contadas. Já as células que tocam os limites inferior e a direita, não devem ser consideradas.
A quantidade de células no primeiro quadrado deve ser anotada. O processo deve ser repetido para os quadrados restantes, anotando os resultados da contagem de todos eles. Quanto maior o número de células contadas, maior a precisão da medição.
Contagem de células
Metodologia
Células Grandes
A contagem de células grandes é realizada pela soma dos compartimentos A1, A2, A3 e A4 e com volume correspondente a 0,4 µL. Cada um dos compartimentos é subdividido em 16 compartimentos médios, totalizando 64 compartimentos.
Ao realizar a contagem na malha, a fórmula a seguir deve ser aplicada para obtenção do número real de células.
A=a x 2,5 x taxa de diluição
A = valor real da contagem de células
a = quantidade de células contadas nos grides
Células Pequenas
A contagem de células pequenas é realizada pela soma dos compartimentos 1, 2, 3, 4 e 5 com volume correspondente a 0,02 µL. Cada um dos compartimentos é subdividido em 16 compartimentos menores, totalizando 80 compartimentos.
Ao realizar a contagem na malha, a fórmula a seguir deve ser aplicada para a obtenção do número real de células.
R=r x 50 x taxa de diluição
R = valor real da contagem de células
r = quantidade de células contadas nos grides
Contagem Automática de Células
A contagem manual é trabalhosa e exige cuidado e atenção, nem sempre os resultados são exatos. Mas a tecnologia tem ajudado a melhorar o método, possibilitando realizar uma leitura de maneira simples e rápida através de softwares instalados no microscópio trinocular.
Através da câmera que permite gravar vídeos e mesmo tirar fotos é possível realizar diversas análises de uma mesma amostra, possibilitando a contagem de forma muito mais rápida e precisa, com a vantagem de arquivar as imagens registradas ou até compartilhá-las.
Contagem de células automática no software do Microscópio Trinocular
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