Você sabe como é preparado o Gel de Agarose na Eletroforese?
A Eletroforese em Gel de Agarose
A eletroforese, separação de moléculas carregadas em um campo elétrico, é uma técnica essencial em qualquer laboratório e o primeiro passo em vários procedimentos. Por meio dela, as moléculas são separadas umas das outras conforme o tamanho, a forma ou a carga.
O gel de agarose é a matriz na qual é aplicada a amostra e que permite realizar a separação dessas moléculas.
A Agarose é um polissacarídeo neutro extraído da parede celular de determinadas algas. Sua estrutura química possibilita a formação de gel altamente resistente, mesmo em baixas concentrações. O gel possui uma estrutura macrorreticular (com aspecto de rede, formando malhas), que pode ser ajustada simplesmente pela variação da concentração de agarose (quanto mais alta a concentração, menor o tamanho dos poros). Isso permite a passagem das moléculas, atuando como peneiras moleculares, e fornece as condições ideais para a realização da eletroforese.
Os géis de baixa percentagem de agarose são relativamente rígido e fáceis de manipular, sendo usados para separa moléculas grandes como o DNA e o RNA, proteínas e complexos proteicos muito grandes. O que é preciso observar é que a concentração do gel deve ser apropriada ao tamanho do fragmento que se está interessado em analisar.
>>Leia mais – Princípios da Técnica de Eletroforese
Preparação do Gel de Agarose
O gel de agarose deve ser preparado ajustando-se a concentração apropriada para separar os fragmentos de DNA presentes na amostra. Vamos descrever a seguir a concentração de 2,5% porém você pode modificar a quantidade de agarose a ser pesada de acordo com o necessário (por ex.: para gel 1,5% pesar apenas 1,5 g).
Reagentes e materiais
- Preparo de 100 mL de gel de agarose 2,5%:
- EPI’s (Equipamento de Proteção Individual);
- 2, 5g de agarose pulverizada;
- 100 mL TBE 1X;
- brometo de etídeo /corante safer;
- Proveta graduada de 100 mL;
- Barca de pesagem ou papel manteiga para pesagem;
- Espátula;
- Balão volumétrico de 500 mL;
- Luva de pano emborrachada.
Equipamentos necessários para o procedimento
- Balança analítica;
- Microondas;
- Cuba horizontal para eletroforese.
Procedimento Técnico
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- Antes de iniciar a atividade paramentar-se adequadamente
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- Ligar e equilibrar a balança. Com auxílio da barca, copo ou papel manteiga pesar a agarose
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- Com auxílio de uma proveta colocar 100 mL de TBE 1X em um balão volumétrico, após, adicionar a agarose pesada e homogeneizar
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- Levar ao microondas para aquecimento por aproximadamente 5 minutos.
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- Solução completamente translúcida (sem bolhas)
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- Despejar em cada cuba 30 mL do gel
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- Colocar o suporte contendo os pentes próprios que servirão como molde para produzir as cavidades (poços) no gel
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- Gel de Agarose
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- Gel de agarose estocado em geladeira imerso em tampão TBE 1X
- Antes de iniciar a atividade paramentar-se adequadamente;
- Ligar e equilibrar a balança. Com auxílio da barca, copo ou papel manteiga pesar a agarose;
- Com auxílio de uma proveta colocar 100 mL de TBE 1X em um balão volumétrico, após, adicionar a agarose pesada e homogeneizar;
- Levar ao microondas para aquecimento por aproximadamente 5 minutos ou até que a solução esteja completamente translúcida (sem bolhas);
- Com auxílio de uma micropipeta adicionar 5 uL de brometo de etídeo no gel e homogeneizar;
- Despejar em cada cuba 30 mL do gel;
- Colocar o suporte contendo os pentes próprios que servirão como molde para produzir as cavidades (poços) no gel;
- Aguardar 10 minutos para polimerização da matriz da agarose, ao esfriar e a agarose fica com o aspecto turvo e com resistência diretamente proporcional à concentração de agarose utilizada;
- Retirar os pentes com cuidado para não danificar a matriz do gel;
- O gel de agarose é colocado no interior da cuba de eletroforese horizontal ou estocado em geladeira imerso em tampão TBE 1X.
Para permitir a visualização, os géis são corados pela adição de corante na amostra ou durante a preparação do gel. Quando diretamente no gel, é corado com brometo de etídio, porém esta é uma substância mutagênica. Já quando corado diretamente na amostra utiliza-se o corante safer, um reagente não mutagênico de toxicidade inferior ao do brometo de etídio e com alto grau de sensibilidade.
Identificação e solução de problemas
O gel ficará inviável quando formarem bolhas e não forem retiradas durante o aquecimento ou quando demorar mais que 20 minutos para polimerizar.
Análise e interpretação dos resultados
O gel de agarose deve ficar homogêneo e translúcido, e sua polimerização se dá em torno de 10 minutos. A funcionalidade do gel de agarose é visualizada através de uma corrida eletroforética, na qual se analisam os padrões das bandas de DNA amplificado.
