A Eletroforese em Gel de Agarose

A eletroforese, separação de moléculas carregadas em um campo elétrico, é uma técnica essencial em qualquer laboratório e o primeiro passo em vários procedimentos. Por meio dela, as moléculas são separadas umas das outras conforme o tamanho, a forma ou a carga.

O gel de agarose é a matriz na qual é aplicada a amostra e que permite realizar a separação dessas moléculas.

A Agarose é um polissacarídeo neutro extraído da parede celular de determinadas algas. Sua estrutura química possibilita a formação de gel altamente resistente, mesmo em baixas concentrações. O gel possui uma estrutura macrorreticular (com aspecto de rede, formando malhas), que pode ser ajustada simplesmente pela variação da concentração de agarose (quanto mais alta a concentração, menor o tamanho dos poros). Isso permite a passagem das moléculas, atuando como peneiras moleculares, e fornece as condições ideais para a realização da eletroforese.

Os géis de baixa percentagem de agarose são relativamente rígido e fáceis de manipular, sendo usados para separa moléculas grandes como o DNA e o RNA, proteínas e complexos proteicos muito grandes. O que é preciso observar é que a concentração do gel deve ser apropriada ao tamanho do fragmento que se está interessado em analisar.

>>Leia mais – Princípios da Técnica de Eletroforese

Preparação do Gel de Agarose

O gel de agarose deve ser preparado ajustando-se a concentração apropriada para separar os fragmentos de DNA presentes na amostra. Vamos descrever a seguir a concentração de 2,5% porém você pode modificar a quantidade de agarose a ser pesada de acordo com o necessário (por ex.: para gel 1,5% pesar apenas 1,5 g).

Reagentes e materiais

• Preparo de 100 mL de gel de agarose 2,5%:
• EPI’s (Equipamento de Proteção Individual);
• 2, 5g de agarose pulverizada;
• 100 mL TBE 1X;
• brometo de etídeo /corante safer;
• Proveta graduada de 100 mL;
• Barca de pesagem ou papel manteiga para pesagem;
• Espátula;
• Balão volumétrico de 500 mL;
• Luva de pano emborrachada.

Equipamentos necessários para o procedimento

• Balança analítica;
• Microondas;
• Cuba horizontal para eletroforese.

Procedimento Técnico

1. Antes de iniciar a atividade paramentar-se adequadamente;
2. Ligar e equilibrar a balança. Com auxílio da barca, copo ou papel manteiga pesar a agarose;
3. Com auxílio de uma proveta colocar 100 mL de TBE 1X em um balão volumétrico, após, adicionar a agarose pesada e homogeneizar;
4. Levar ao microondas para aquecimento por aproximadamente 5 minutos ou até que a solução esteja completamente translúcida (sem bolhas);
5. Com auxílio de uma micropipeta adicionar 5 uL de brometo de etídeo no gel e homogeneizar;
6. Despejar em cada cuba 30 mL do gel;
7. Colocar o suporte contendo os pentes próprios que servirão como molde para produzir as cavidades (poços) no gel;
8. Aguardar 10 minutos para polimerização da matriz da agarose, ao esfriar e a agarose fica com o aspecto turvo e com resistência diretamente proporcional à concentração de agarose utilizada;
9. Retirar os pentes com cuidado para não danificar a matriz do gel;
10. O gel de agarose é colocado no interior da cuba de eletroforese horizontal ou estocado em geladeira imerso em tampão TBE 1X.

Para permitir a visualização, os géis são corados pela adição de corante na amostra ou durante a preparação do gel. Quando diretamente no gel, é corado com brometo de etídio, porém esta é uma substância mutagênica. Já quando corado diretamente na amostra utiliza-se o corante safer, um reagente não mutagênico de toxicidade inferior ao do brometo de etídio e com alto grau de sensibilidade.

Identificação e solução de problemas

O gel ficará inviável quando formarem bolhas e não forem retiradas durante o aquecimento ou quando demorar mais que 20 minutos para polimerizar.

Análise e interpretação dos resultados

O gel de agarose deve ficar homogêneo e translúcido, e sua polimerização se dá em torno de 10 minutos. A funcionalidade do gel de agarose é visualizada através de uma corrida eletroforética, na qual se analisam os padrões das bandas de DNA amplificado.