Genética Forense: Teste de Paternidade

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Nosso DNA é formado por metade da genética de nossa mãe e por metade de nosso pai. A não ser nos casos de gêmeos univitelinos, cada indivíduo possui seu próprio código genético. Assim como cada pessoa possui uma exclusiva impressão digital, também possui uma exclusiva impressão genética. Cada gene possui uma diversidade muito grande de alelos. Sabe-se que mais de 11 mil já foram identificados em todo o mundo. Por isso, é muito raro que dois indivíduos tenham o mesmo grupo de genes.

O DNA de cada ser humano é único e diferente dos demais e possui a função de carregar todas as nossas características, coordenando o funcionamento e desenvolvimento de nosso organismo, além de transmitir nossa herança genética aos nossos filhos.

O teste de paternidade durante anos apresentou um desafio significativo para cientistas e pais em potencial. Durante a primeira metade do século XX, os pesquisadores recorriam para os fenótipos ABO das pessoas quando necessário algum reconhecimento. No entanto, as informações do grupo sanguíneo só podiam ser usadas para excluir pais em potencial, em vez da confirmação de fato.

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Nas décadas de 1980 e 1990, o surgimento das técnicas de análise e sequenciamento de DNA para fins de identificação pessoal e determinação de paternidade é considerado o maior avanço do século na área forense. Com o exame de DNA, a determinação de paternidade passou a atingir níveis de certeza absoluta.

O pioneiro da genética forense

Em julho de 1985 o geneticista inglês Alec Jeffreys publicou na revista Nature um artigo sobre uma técnica laboratorial de estudo simultâneo de múltiplas regiões do DNA com ’lanternas químicas’ denominadas sondas multilocais. Essas sondas eram capazes de reconhecer simultaneamente um grande número de minissatélites muito variáveis no DNA. O resultado era um padrão de bandas absolutamente individuais, similar a um código de barras, que ele chamou de ‘impressões digitais de DNA’ (DNA fingerprinting), em analogia às dos polegares.

Em relação ao uso criminal, a primeira aplicação foi a identificação do criminoso que violentou e assassinou duas jovens em Narborough, Leicestershire em 1983 e 1986.

Essa descoberta tornou possível comparar o padrão genético de dois ou mais indivíduos e, pela primeira vez, também poderia se comprovar com certeza absoluta (superior a 99,9999%) se um indivíduo seria ou não o pai biológico de uma criança.

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Extração do DNA

A extração de DNA e sua purificação são de primordial importância para o resultado preciso. Alguns procedimentos básicos são realizados para isolar e purificar o DNA. São eles:

Etapa de Lise
	O primeiro passo consiste em realizar a lise (quebra) da célula para expor o DNA.

Ligação
	Uma membrana de sílica retém e concentra o DNA.

Etapa de Lavagem
	Quebrar e emulsionar a gordura e as proteínas que formam a membrana da célula. Isto normalmente é feito utilizando soluções detergentes e por centrifugação. As etapas de lavagem removem estes resíduos contaminantes, restando apenas a membrana com o DNA.

Etapa de Eluição
	Por fim ocorre a liberação dos ácidos nucléicos (DNA/ RNA) da membrana. Isto proporciona o DNA purificado pronto para ser utilizado em diferentes aplicações.

O rendimento e a qualidade do DNA extraído dependem muito do kit utilizado e podem interferir no resultado de testes realizados posteriormente. Por isso a obtenção de DNA de alta qualidade é essencial, garantindo assim o sucesso das etapas seguintes.

Quando se fala em PCR essa escolha é decisiva, pois a sensibilidade de detecção é diferente e a demora em algumas etapas pode aumentar a probabilidade de falha devido à manipulação, alterando o resultado final.

Método do PCR (Polymerase Chain Reaction)

O princípio básico da PCR está na capacidade de, a partir de quantidades mínimas de DNA, multiplicar uma determinada sequência para análise. Uma das vantagens dessa técnica é a diversidade de amostras possíveis para a extração do DNA: pode ser obtido a partir amostras de sangue, saliva, fluído amniótico, urina, fezes ou até mesmo fios de cabelo e unhas.

O ciclo de PCR consiste em três etapas principais: desnaturação (separação da dupla fita de DNA), anelamento (iniciadores determinam a região a ser copiada) e extensão (conhecida como alongamento, a enzima DNA polimerase complementa a fita, formando novamente uma dupla fita).

O ciclo inteiro é então reiniciado, os produtos do primeiro ciclo de replicação são então desnaturados, anelados e novamente replicados com DNA-polimerase. O procedimento é repetido muitas vezes até que a quantidade desejada de amplificação seja obtida.

Na prática, a amplificação efetiva do DNA requer de 20 a 30 ciclos de reação, com os produtos de cada ciclo servindo como DNA-molde para o próximo – dando origem ao termo “reação em cadeia” da polimerase.

Como cada etapa da reação ocorre em uma temperatura específica, a reação pode ser controlada. É utilizado um termociclador para determinar a temperatura e o tempo de cada etapa, bem como o número de ciclos de replicação.

A detecção do produto de amplificação normalmente é feita em eletroforese em gel de agarose, que é corado com brometo de etídio ou corantes não mutagênicos, permitindo a visualização direta do DNA pesquisado.

Eletroforese

Os fragmentos de DNA resultantes são então processados usando eletroforese. A separação e detecção destes fragmentos resulta em um padrão único de bandas, a impressão digital genética. Este padrão é usado em investigações de paternidade para comparar o DNA do suposto pai ou mãe com DNA do filho.

Sequenciamento de Nova Geração: Next-Generation Sequence (NGS)

Hoje em dia o chamado sequenciamento de nova geração (NGS – Next Generation Sequencing) permitiu aumentar consideravelmente a escala das análises genômicas, sequenciando e genotipando milhares de regiões e genomas de interesse em um único passo, gerando um grande volume de dados biológicos (high throughput sequencing -HTS). Assim, os termos NGS, HTS ou sequenciamento massivo paralelizado, constituem um conceito genérico, englobando as diversas metodologias distintas para o sequenciamento de DNA que geram um grande volume de dados em comparação ao padrão da metodologia de Sanger, dispensando a necessidade de clonagem in vivo dos fragmentos de DNA. Mesmo em organismos sem informações genéticas prévias, estes avanços tecnológicos em biologia molecular e sequenciamento em larga escala vêm permitindo inúmeras análises genômicas e transcriptômicas, contribuindo para a compreensão e o estudo da variação biológica, através da descoberta de marcadores moleculares e genes importantes para rotas metabólicas e vias fisiológicas.

Antes, o reconhecimento de paternidade no Brasil era realizado somente via judicial através de processo apresentado a um juiz de direito, com manifestação do Ministério Público e presença de advogados. O processo, muitas vezes, levava anos para ser finalizado. Agora, o processo é mais rápido e feito diretamente em cartório. Ele pode ser feito de maneira espontânea pelo pai ou solicitada pela mãe ou filho. Em todo caso, é necessário ir ao cartório de registro civil dar início ao processo. A via judicial ainda permanece válida quando o pai se recusa a reconhecer o filho.