PIVE: Como é realizada a produção in vitro de embriões?

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Na última década o Brasil se tornou referência na produção in vitro de embriões (PIVE) bovinos. Nos anos de 2012 e 2013 o país chegou a ser líder mundial nesse segmento, tornando-se vanguarda em técnicas como aspiração folicular orientada por ultrassonografia transvaginal (OPU) para obtenção de oócitos (células reprodutivas da fêmea bovina).

Países europeus e os Estados Unidos passaram a investir a mesma técnica ganhando mais espaço com o passar dos anos. Atualmente, o Brasil responde por 34,8% da produção global dos embriões, sendo ainda uma fatia importante do mercado.

O que é a PIVE?

A produção in vitro de embriões (PIVE) é uma técnica de reprodução assistida que consiste na preparação e co-cultivo de gametas em ambiente laboratorial para geração do zigoto, e seu cultivo até o estádio de desenvolvimento embrionário desejado.

A técnica contém uma série de procedimentos integrados, que vão desde o manejo reprodutivo das doadoras e receptoras, punção folicular guiada por ultrassom, procedimentos no laboratório até a transferência dos embriões.

A PIVE tem sido muito utilizada para maior aproveitamento de animais mais aptos à reprodução. A fêmea em condições fisiológicas, tem a produção de até 10 bezerros durante sua vida produtiva. Por aspiração folicular, são recuperados, em média, 30 oócitos viáveis, chegando a 2.880 oócitos viáveis por ano por animal.

As principais aplicações da PIVE envolvem:

1. Reprodução assistida de animais (fêmeas) de alto valor genético portadores de patologias reprodutivas adquiridas;

2. Melhoramento genético animal, ou seja, o aumento da intensidade de seleção
e redução do intervalo entre gerações;

3. Pesquisa dos processos envolvidos na fecundação de gametas e no desenvolvimento embrionário inicial;

4. Possibilidade de formação de um banco de germoplasma para conservação de espécies.

Preparação dos gametas

Para que a técnica tenha o resultado desejado, é necessária a preparação adequada dos gametas feminino e masculino, assim como meios de cultivo e condições favoráveis para que ocorra a fertilização.

Os oócitos são capturados por meio de uma aspiração folicular que pode ocorrer em animais vivos ou já abatidos. A maturação dos oócitos envolve uma série de transformações nucleares, citoplasmáticas e moleculares que tornam o gameta feminino apto a ser fecundado.

Vários laboratórios utilizam o sêmen congelado. Após descongelamento, é necessário selecionar espermatozoides vivos e aptos à fecundação.

O potencial de adquirir a competência para fecundar é denominada capacitação espermática. Para isso, precisa ocorrer uma desestabilização da membrana plasmática dos espermatozoides pela remoção de algumas proteínas, sem modificações morfológicas, resultando em uma hiperativação espermática.

Procedimentos para a fecundação

O material Biotécnicas da Reprodução em Bovinos, da Embrapa, traz algumas orientações para a realização da fecundação in vitro (FIV).

1 – Preparação da placa de fecundação

Em uma placa de Petri preparar gotas de 10 μL de meio de fecundação, recobrí-las com óleo mineral e equilibrar em estufa incubadora por duas horas, antes do início do período de fecundação.

2 – Preparação do Sêmen

Neste momento são empregados métodos de seleção espermática para o sucesso da fertilização. O Swim-up pode melhorar alguns dos parâmetros relacionados a estrutura da cromatina do espermatozoide.

Procedimentos para swim-up

Confira o passo a passo do Swim-up:

– Adicionar 1 mL de SPTL em um tubo de fundo cônico de 15 mL, tampar, sem vedar, a rosca dos tubos e manter em estufa incubadora para estabilizar o meio.

– Descongelar a palheta de sêmen em banho-maria a 37 ºC por 30 segundos. Em seguida, verter o conteúdo da palheta cuidadosamente no fundo do tubo contendo SPTL e mantê-lo apoiado dentro de um becker em posição inclinada. Lembrar de retirar uma pequena amostra de sêmen para analisar a motilidade e vigor do sêmen antes da incubação em estufa.

– Manter o tubo Falcon com o sêmen por 1 hora em estufa incubadora nas mesmas condições da maturação.

– Após 1 hora, remover o sobrenadante e transferí-lo para um novo tubo Falcon previamente aquecido.

– Remover uma segunda amostra de sêmen para analisar motilidade e vigor.

– Centrifugar o tubo Falcon com o sêmen por 8 minutos a 1.200 RPM em centrífuga sorológica.

– Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet com meio FERT-TALP (previamente equilibrado na incubadora) para um volume final de 100 μL.

– Deixar o tubo na incubadora enquanto se processa a contagem espermática.

Em seguida, deve ser realizada a técnica de Percoll. Este método proporciona maior recuperação de espermatozoides móveis e com mais qualidade.

Procedimentos para o Mini Percoll

Estes são os procedimentos para realizar a preparação do Mini Percoll:

– Preparar um tubo cônico com capacidade de 1,5 mL com gradiente de Percoll, pela adição de 250 μL de Percoll 90% e, sobre esta camada, depositar 250 μL de gradiente Percoll 45%, vagarosamente, de maneira que as duas camadas não se misturem.

– Equilibrar a temperatura e atmosfera do gradiente de Percoll em incubadora por aproximadamente 1 hora antes do uso.
– Após o descongelamento do sêmen, o conteúdo da palheta deve ser depositado sobre as camadas de Percoll previamente aquecidas (não deixar o sêmen se misturar com as camadas de Percoll).
– Centrifugar o tubo em uma microcentrífuga a 8.000 RPM, por 7 minutos.

– Remover o sobrenadante, ressuspender o pellet com 1 mL de meio FERT e centrifugar novamente por 5 min, utilizando a força de 3.200 RPM.

– Remover 60 μL do pellet formado e transferir para outro eppendorf.
– Transferir 5 μL para eppendorf contendo 50 μL de meio FERT para análise de motilidade progressiva.

Após os procedimentos para descongelamento, deve-se realizar a contagem espermática e ajuste da concentração do sêmen:
– Diluir 5 μL da amostra do sêmen em 250 μL de água e homogeneizar bem.

– Contar os espermatozóides em 5 retículos da câmara de Neubauer para se determinar o volume de meio FERT-TALP a ser adicionado.

Fecundação in vitro

Após ajuste da concentração espermática transferir, no máximo 20 oócitos por gota, adicionar volume espermático e completar com FERT para volume final de 50 a 100 μL, de acordo com o protocolo adotado no laboratório.

– Antes de transferir os oócitos para gota de fecundação, lavar, ao menos duas vezes, em meio FERT previamente equilibrado e aquecido.

– Incubar os oócitos juntamente com os espermatozóides por um período de 18 a 22 horas, nas mesmas condições de atmosfera, temperatura e umidade adotadas para a maturação in vitro.

Desenvolvimento do embrião

O período de desenvolvimento embrionário pré-implantação é marcado por importantes eventos, como clivagem, ativação do genoma embrionário, compactação dos blastômeros, diferenciação do trofoblasto e embrioblasto, formação e expansão da blastocele e rompimento da zona pelúcida.

Esses fenômenos podem ser afetados de muitas formas no cultivo in vitro, sendo o ponto crítico do desenvolvimento a ativação do genoma embrionário, que se dá por
volta do estádio de 8-16 células.

A PIVE no Brasil

O Brasil é um país bastante competente no desenvolvimento dessas técnicas. Somente em 2014, o Brasil produziu 70,8% dos embriões de FIV no mundo.

Daqui em diante, é importante buscar formas de minimizar as perdas embrionárias na pré-implantação uterina, pois apenas 50% dos embriões transferidos chegam até o final da gestação.