História e evolução da técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction ou Reação em Cadeia da Polimerase)

A PCR (Polymerase Chain Reaction ou Reação em cadeia da Polimerase) é uma técnica pela qual moléculas de DNA são amplificadas milhares ou milhões de vezes de uma forma bastante rápida. Todo o procedimento é realizado in vitro, gerando DNA em quantidade suficiente para análises posteriores.

A técnica é muito sensível, possibilitando a amplificação de DNA a partir de uma quantidade mínima de amostra. Essa característica tem proporcionado a aplicação da técnica não apenas na pesquisa básica, mas também na pesquisa aplicada, como nos testes de identificação genética, medicina forense, diagnóstico de doenças infecciosas, controle de qualidade industrial, entre outros.

> Qual a importância da extração de DNA em um procedimento de PCR?

O desenvolvimento da técnica de amplificação de segmentos de DNA, utilizando a PCR ampliou perspectivas em várias áreas do conhecimento. Nos experimento iniciais de PCR, utilizou-se a enzima de DNA polimerase de E. Coli, cuja temperatura de polimerização é de 37°C. Ela era adicionada manualmente a cada ciclo de amplificação, mas era destruída toda vez que a temperatura era elevada para 95°C para promover a desnaturação do DNA molde.

O passo decisivo para a expansão da PCR foi a descoberta da enzima taq polimerase, extraída da bactéria Thermus aquaticus. Esse organismo vive em fontes termais e muitas de suas enzimas são termoestáveis (resistentes à desnaturação pelo calor). Essa característica especial tornou-a adequada para utilização em metodologias como a PCR que envolve etapas de aquecimento a temperaturas de mais de 90°C.

Um avanço importante na técnica de PCR foi o desenvolvimento de metodologias que possibilitaram o acompanhamento da amplificação do DNA em todo o processo e não somente em seu final (PCR convencional). A PCR em tempo real quantitativa (ou qPCR) é um método de detecção e quantificação confiável dos produtos gerados durante cada ciclo de amplificação, os quais são proporcionais à quantidade de molde disponível no início do processo de PCR. Ou seja, permite que a amplificação e detecção ocorram simultaneamente, sendo o resultado visualizado em tempo real durante a amplificação da sequência de interesse.

> Qual a diferença entre PCR e qPCR?

Confira na linha do tempo os principais acontecimentos e a evolução dessa técnica:

• 1983 – Criação da técnica por Kary Mullis.
• 1985 – Apresentação da pesquisa à comunidade científica e publicação na revista “Science”.
• 1986 – Taq polimerase – a descoberta da bactéria Termus aquaticus e extração de sua DNA polimerase possibilitou o aperfeiçoamento da técnica, que não necessitava de adição de mais DNA polimerase a cada ciclo, pois a mesma suporta temperaturas acima de 100°C.
• 1987 – Com a patente da PCR por parte da Perkin, desenvolve-se a automação para controle do aumento e redução da temperatura, neste momento surge o Temociclador.
• 1992 – Primeiro teste diagnóstico desenvolvido para HIV, descartando o problema da janela imunológica estabelecida pelo vírus.
• 1993 – Karry Mullis recebe o Prêmio Nobel de Química.
• 2003 – Desenvolvimento da PCR em Tempo Real ou qPCR– técnica de PCR na qual utiliza-se além dos primers (iniciadores de amplificação), as sondas marcadas, possibilitando a quantificação do alvo em estudo.

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Referência:
Arnaldo, ZAHA, FERREIRA, Henrique Bunselmeyer, and PASSAGLIA, Luciane M. P. – organizadores. Biologia Molecular Básica, 4ª edição. ArtMed, 2012.