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Aplicações da Microplaca de Microtitulação

  • placa de microtitulação

Conheça algumas metodologias que utilizam a microplaca para análise

As microplacas de microtitulação possuem uma versatilidade muito grande e são usadas em diversos tipos de laboratórios com aplicações para metodologias diferentes. As microplacas, chamadas também de placas de microtitulação, têm uma base plana e se parecem com uma bandeja com múltiplos poços. Estes são utilizados como pequenos tubos de ensaios nos quais são depositados os reagentes.

Uma microplaca pode ser fabricada a partir de diversos materiais, porém o mais comum é o Poliestireno (PS). Suas propriedades físicas são perfeitas para atender as necessidades dos ensaios, pois aceitam a grande variação de temperaturas empregadas.

Esquema de Microplacas com fundo Chato. Fundo U e Fundo V

Esquema de Placas com fundo Chato. Fundo U e Fundo V

A identificação alfanumérica em suas bordas também facilita a visualização e organização das amostras. Possui ainda diversas apresentações com poços em formato plano (fundo chato), arredondado (fundo U) e cônico (fundo V), sendo a mais frequente com tamanho de 96 poços. Além de ser uma ferramenta simples e encontrada em todos os tipos de laboratório, a microplaca é utilizada em muitas análises, como sorologia, absorbância, EIA, ELISA, aglutinação, ensaios colorimétricos e muitos outros.

Nessa publicação vamos abordar algumas aplicações da microplaca de microtitulação. As metodologias que você confere a seguir com mais detalhes são: ELISA, aglutinação e ensaio colorimétrico.

Metodologia ELISA utilizando microplaca

O uso mais comum da microplaca está relacionado à metodologia ELISA (do inglês, Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) também chamado de imunoensaio enzimático. É utilizada principalmente em imunologia para detectar a presença de um anticorpo ou um antígeno em uma amostra.

Existem duas variações principais: o teste pode ser usado para detectar a presença de antígenos que são reconhecidos por um anticorpo ou pode ser usado para testar anticorpos que reconhecem um antígeno.

Em um teste de ELISA para identificar um vírus, por exemplo, um anticorpo conhecido contra o vírus é ligado a uma superfície (neste caso, no fundo de uma microplaca). Se o vírus estiver presente na amostra ele se ligará ao anticorpo. Uma amostra de um anticorpo ligado a uma enzima é adicionada, e irá ligar-se ao vírus preso. O substrato da enzima é adicionado, esta etapa irá gerar um sinal visível que se caracteriza pela mudança de cor, utilizada para determinar a presença do vírus de interesse.

Já se o paciente apresenta anticorpos contra um antígeno microbiano ou viral, esses anticorpos se ligarão aos antígenos microbianos ou virais aderidos no fundo da microplaca. O anticorpo contra IgG humana conjugada com a enzima se ligará aos anticorpos do paciente. Então, quando o substrato for adicionado, este mudará de cor, indicando que o soro do paciente continha anticorpos.

Ensaio imunoadsorvente ligado à enzima (ELISA)

Ensaio imunoadsorvente ligado à enzima (ELISA). LEVINSON, Warren. Microbiologia Médica e Imunologia, 13th edição. AMGH, 2016.

 

O ensaio ELISA originar três tipos diferentes de resultados, conforme o objetivo pretendido:

  • Quantitativo: podem ser interpretados em comparação com uma curva padrão para calcular com precisão as concentrações de antígeno em várias amostras.
  • Qualitativo: determinando se um teste é positivo ou negativo.
  • Semi-quantitativo: podem ser usados para comparar os níveis relativos de antígeno em amostras, uma vez que a intensidade do sinal varia diretamente com a concentração de antígeno.

 

Aplicação

A metodologia ELISA é utilizada no diagnóstico de diferentes doenças infecciosas, como Chikungunya, Dengue, Zika, HIV e Hepatites.

 

Aglutinação em placa de microtitulação

A aglutinação é uma reação entre um anticorpo e um antígeno particulado (como bactérias e hemácias), resultando em uma aglomeração de partículas visíveis. Quando hemácias são utilizadas, o teste é denominado hemaglutinação. Ensaios de aglutinação podem ser realizados de diversas formas, uma delas é através das placas de microtitulação.

 

Princípio de imunoensaio por aglutinação

Princípio de imunoensaio por aglutinação. MCPHERSON, Richard A., PINCUS, Matthew (eds.). Diagnósticos Clínicos e Tratamento por Métodos Laboratoriais de Henry, 21st edição. Manole, 2012

 

A aglutinação pode ocorrer tanto com partículas artificiais/imobilizadas (como látex e poliestireno) como biológicas (como hemácias e bactérias). Estas partículas conjugadas são colocadas para reagir com o soro do paciente presumivelmente contendo anticorpos.

O resultado do teste consiste na observação de aglomerados, resultantes dessa formação do complexo antígeno-anticorpo.

  • Padrão positivo – indicativos de que a reação ocorreu, mostrando um padrão de aglutinação expandido das partículas. Forma-se uma rede de hemácias unidas aos anticorpos se espalhando por toda a superfície do poço.
  • Padrão negativo – indica que a reação não ocorreu, as hemácias se depositam no fundo do poço mostrando um aglomerado em forma de botão.
  • Inconclusivo – há uma combinação dos dois padrões anteriores e não é possível definir se a amostra é reagente ou não.

 

Aplicação

Os testes de aglutinação são amplamente utilizados em laboratórios clínicos e de diagnóstico. Sua utilização mais comum é para determinação do grupo sanguíneo ABO. As reações de aglutinação podem ser realizadas para o diagnóstico de doenças causadas por vírus, bactérias, protozoários, fungos e doenças autoimunes.

 

Ensaio colorimétrico – MTT

A colorimetria é uma técnica analítica que avalia a capacidade de certos compostos absorverem luz em comprimento de onda específico. A medida de luz absorvida permite inferir a quantidade de alguma substância que está dissolvida em uma solução ou amostra biológica.

Essa técnica, conhecida também por fotometria ou espectrofotometria, é utilizada para determinar a concentração de moléculas coloridas ou incolores que, ao reagirem com outras moléculas, formam cor.

Essa metodologia baseia-se em dois princípios:

  • A intensidade de cor de uma solução é diretamente proporcional à concentração de soluto.
  • Cada substância é capaz de absorver ou transmitir luz em um determinado comprimento de onda.

Uma das maneiras de estimar o número de células viáveis que crescem em poços de placa de microtitulação é usando um ensaio colorimétrico e um espectrofotômetro. Este ensaio proporciona um modelo simples e eficaz para detectar células vivas e em crescimento.

O princípio do método é baseado na redução por células vivas de sal de tetrazólio (MTT), para formar um produto de Formazan. Após redução, o MTT (amarelo) forma cristais de Formazan (roxo-azulado) que ao serem dissolvidos absorvem na região do visível, podendo desta forma ser quantificados por espectrofotometria. A quantidade de Formazan produzido é diretamente proporcional ao número de células viáveis presentes no experimento.

Microplaca - Ensaio MTT

Microplaca – Ensaio MTT

 

Os ensaios que medem a atividade metabólica são adequados para analisar a proliferação, viabilidade e citotoxicidade das células.

Microplacas de Microtitulação Kasvi

 


Referências

LEVINSON, Warren. Microbiologia Médica e Imunologia, 13th edição. AMGH, 2016.

MADIGAN, Michael T., MARTINKO, John M., BENDER, Kelly S., BUCKLEY, Daniel H., STAHL, David A. Microbiologia de Brock, 14th edição. ArtMed, 2016.

MCPHERSON, Richard A., PINCUS, Matthew (eds.). Diagnósticos Clínicos e Tratamento por Métodos Laboratoriais de Henry, 21st edição. Manole, 2012.

BELLÉ, Luziane Potrich, SANDRI, Silvana. Bioquímica Aplicada – Reconhecimento e Caracterização de Biomoléculas. Érica, 2014.

ORÉFICE, Rodrigo Lambert, PEREIRA, Marivalda Magalhães, MANSUR, Herman Sander. Biomateriais – Fundamentos & Aplicações. Guanabara Koogan, 2012.