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Cultura Celular: Contaminação por Mycoplasma

  • Cultura Celular

A cultura celular continua crescendo há 60 anos em uso e importância não apenas na pesquisa acadêmica, medicina terapêutica personalizada, como medicina regenerativa e descoberta de drogas. Novas terapias, vacinas e medicamentos, bem como órgãos regenerados e sintéticos, virão cada vez mais de células de mamíferos cultivadas in vitro.

No entanto, a contaminação biológica é o temor e uma realidade para quem trabalha com cultura de células. Quando as culturas são infectadas com microrganismos, ou contaminadas por células exógenas, faz-se o tratamento com antibióticos, no entanto, em alguns casos, devem ser destruídas.

O Mycoplasma é uma bactéria difícil de se detectar e pode infectar e contaminar culturas de células em incubadoras, se espalhando facilmente. Por isso, ter uma contaminação por Mycoplasma é um problema muito sério na maioria dos laboratórios.

Aplicações da Cultura Celular

Sem dúvida, a cultura celular é utilizada em uma ampla gama de atividades, desde estudos sobre proliferação celular até a produção de substâncias biologicamente ativas. E certamente, devido às restrições ao uso de animais de laboratório pelas leis de proteção animal, o uso de culturas de células in vitro vêm crescendo significativamente.

A cultura celular na pesquisa científica é uma tecnologia amplamente empregada para elucidar desde os mecanismos básicos da célula até processos mais complexos como sinalização, funcionamento e comportamento de tecidos humano, animal ou vegetal. Com o passar do tempo, aliada à evolução da engenharia celular e genética, esta ferramenta deixou de se limitar a fins experimentais e ampliou as perspectivas para o seu uso, possibilitando o escalonamento do cultivo de diversos tipos celulares com fins biotecnológicos e farmacêuticos. As empresas deste setor investem na produção de biofármacos e bioderivados, como proteínas recombinantes (eritropoietina humana, fator VIII da cascata de coagulação), anticorpos monoclonais para imunoensaios e vacinas. Paralelamente, as células cultivadas também passaram a ser alvo da medicina regenerativa, que vem despontando como uma modalidade terapêutica e promissora. Assim, o cultivo celular se estabeleceu como ferramenta para obtenção de células para tratamento e reconstrução de tecidos lesados. Desse modo, o cultivo de células se firmou como um dos pilares para a biologia celular e molecular, fazendo desta, uma prática laboratorial disseminada e rotineira.

O que causa contaminação biológica?

A expansão de células ex vivo por um longo período aumenta o risco de contaminações por agentes microbianos que afetam a qualidade e segurança do produto. Qualquer descuido durante a manipulação pode resultar em contaminação das células, isso porque o cultivo é realizado em sistema aberto e os meios de cultura são extremamente ricos em nutrientes.

Dessa maneira, os microrganismos contaminantes mais frequentemente encontrados podem ser divididos em dois subgrupos: bactérias e fungos, que em geral, apresentam uma elevada taxa de crescimento, com rápida identificação da contaminação. E aqueles que são mais difíceis de detectar e, portanto, apresentam problemas potencialmente mais graves, que incluem os Mycoplasmas, vírus e contaminação cruzada por outras células de mamíferos.

Bactérias e Fungos

A contaminação por bactérias e fungos, incluindo bolores e leveduras, é de fácil reconhecimento e, são passíveis de tratamento com antibióticos. Em contrapartida, na ausência de antibióticos, pode-se identificar as bactérias em uma cultura dentro de alguns dias de contaminação, seja por observação microscópica ou por seus efeitos diretos na cultura (alterações de pH, turbidez e morte celular). As leveduras geralmente fazem com que o meio de crescimento fique muito turvo, enquanto os bolores produzirão micélio ramificado, que ocasionalmente aparecem como aglomerados peludos flutuando no meio de cultura.

Cultura contaminada com fungo. Foto e todos os direitos de imagem Luana Ebbinghaus.

Vírus

Os vírus não fornecem pistas visuais da sua presença; eles não alteram o pH do meio de cultura nem resultam em turbidez. Como os vírus usam seu hospedeiro para replicação, os medicamentos usados para bloquear os vírus também podem ser altamente tóxicos para as células que estão sendo cultivadas. Os vírus que causam danos à célula hospedeira. Tendem a ser autolimitados, e por isso a maior preocupação com a contaminação viral é seu potencial de infectar os usuários do laboratório. Por isso, aqueles que trabalham com células humanas ou outros primatas devem tomar precauções adicionais de biossegurança.

Contaminação Cruzada

A contaminação cruzada de uma cultura de células com outros tipos de células é um problema sério, mas que só recentemente foi considerado alarmante. O problema ocorre quando um tipo de célula estranha se adapta melhor às condições de cultura e, portanto, substitui as células originais. Certamente tal contaminação claramente coloca um problema para a qualidade da pesquisa produzida, e o uso de culturas contendo tipos errados de células pode levar à retração do resultado publicado.

Mycoplasmas

Os mycoplasmas são certamente os mais graves e disseminados de todos os contaminantes biológicos. Isso se dá pela sua baixa taxa de detecção e ao seu efeito destrutivo nas células de mamíferos.

Pertencem à classe dos Mollicutes, cuja principal característica é a falta de parede celular e sua forma semelhante ao plasma. Eles são muito menores que a maioria das bactérias (0,15 a 0,3 μm), então eles podem crescer para densidades muito altas sem sinais visíveis. Ou seja, apresentam dificuldade de identificação mesmo ao microscópio eletrônico de alta potência. Assim, o pequeno tamanho é o principal motivo de sua fuga por sistemas de filtragem usadas na esterilização. Por fim, como os antibióticos mais comuns atingem as paredes celulares bacterianas, os mycoplasmas são altamente resistentes.

São altamente infecciosos, para todos os tipos de células eucarióticas, incluindo células primárias. Estes microrganismos possuem uma grande limitação para sintetizar componentes para seu metabolismo. Por isso necessitam de componentes da célula hospedeira para sua replicação e sobrevivência. Isso os torna extremamente prejudiciais para qualquer cultura de células, pois alteram as funções celulares, como metabolismo e crescimento celular, provocando respostas citopáticas e levando à morte celular. Após a adesão ou fusão com a membrana da célula hospedeira, por isso podem causar mais danos à célula, interferindo nas cascatas de sinalização e na produção de citocinas. Por fim, esses efeitos prejudiciais podem impactar fortemente os resultados científicos e invalidar os resultados de um estudo.

Relatórios de vários países mostram que 10 a 87% de culturas de células são infectados por Mycoplasmas. As espécies mais frequentes permaneceram essencialmente as mesmas ao longo dos anos, com destaque para M. hyorhinis, M. orale, M. arginini, e A. laidlawii.

Diversas podem ser as fontes de origem das contaminações em células de cultura. Tempos atrás, a principal fonte desse tipo de contaminação era o soro fetal bovino SFB (25-40% dos lotes de soro contaminados). Esta contaminação diminuiu significantemente devido aos esforços dos fabricantes em relação à prevenção e ao controle de qualidade

Como a maior porcentagem dos Mycoplasma spp. encontrados em cultura celular é de origem humana e as espécies são sempre as mesmas, supõe-se que a principal fonte de contaminação seja o próprio homem. Espécies não patogênicas (para pessoas imunocompetentes) fazem parte da flora microbiana humana. Além disso, linhagens celulares contaminadas por Mycoplasma são importantes fontes de difusão da contaminação, uma vez que aerossóis são formados com facilidade durante a manipulação das células e apresentam sobrevivência prolongada mesmo em superfícies secas.

O método utilizado na detecção pelo corante fluorescente Hoechst, Cultura isenta de microplasma. Foto e todos os direitos de imagem: Fernanda Sousa
O método utilizado na detecção pelo corante fluorescente Hoechst Cultura contaminada por micoplasma. Foto e todos os direitos de imagem: Fernanda Sousa

Conhecer as fontes de contaminação microbiana é crucial para minimizar o risco para as culturas celulares. Você pode tomar várias medidas para prevenir a infecção. Primeiro, verifique se você está trabalhando em um ambiente estéril e usando a técnica asséptica adequada. Em segundo lugar, faça a quarentena de todas as culturas celulares recebidas até que seja confirmada a livre contaminação. Em terceiro, monitore regularmente as culturas de células em busca de contaminação por kits de microscopia óptica e detecção. E por fim, realizar a implantação e desenvolvimento de metodologias de pureza e autenticidade celulares, com o objetivo de agregar confiabilidade e reprodutibilidade dos dados gerados.

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Referências: