PCR em Tempo Real (qPCR): Aplicação no diagnóstico de Doenças
A tecnologia de PCR em Tempo Real (qPCR) é uma evolução do método de PCR (Polymerase Chain Reaction ou Reação em Cadeia da Polimerase). Seu princípio se baseia na duplicação de cadeias de DNA “in vitro” que pode ser repetida diversas vezes, gerando quantidade de DNA suficiente para realizar diversas análises. Com apenas um único fragmento de DNA é possível reproduzir milhões de cópias.
A PCR foi desenvolvida no final dos anos 80 por Kary Mullis que posteriormente ganhou o Prêmio Nobel de Química pelo feito. Além de revolucionar as técnicas de genética molecular, sua aplicação compreende várias áreas como identificação genética, medicina forense, análises clínicas, diagnóstico de doenças, controle de qualidade industrial, entre outros.
Os ensaios de PCR em Tempo Real são muito mais sensíveis, específicos e rápidos, principalmente quando comparados aos testes convencionais, levando de 2 a 3 horas para emitir o resultado.
Para diagnósticos, são amplamente utilizados na infectologia clínica para a detecção de patógenos, identificando infecções virais e bacterianas, em que a cultura dos agentes causadores pode ser muito difícil ou até mesmo impossível. Este método não depende do isolamento ou crescimento do patógeno ou da detecção de uma resposta imune contra o agente.
Em vez disso, o que é detectado nos ensaios são as sequências de ácidos nucleicos dos patógenos. Alguns exemplos de sua aplicação consistem no diagnóstico de dengue, infecções respiratórias, ISTs, anteriormente chamada de DSTs, e meningites.
É utilizada também no diagnóstico de doenças genéticas, identificando mutações e pré-disposição genética para determinadas doenças, como é o caso da trombose.
Essa técnica molecular também é utilizada na oncologia para identificação do cromossomo Philadeplhia, uma alteração citogenética que está associada a algumas formas de leucemia.
Como é realizada a técnica de PCR em tempo real (qPCR)?
A sigla qPCR significa PCR quantitativa em Tempo Real, traduzido do inglês Real Time quantitative PCR ou ainda RT-qPCR. Isto porque a metodologia permite realizar a quantificação do alvo durante o processo de amplificação do DNA.
Para entender completamente o que é a qPCR precisamos entender primeiro qual é o processo da PCR.
PCR Convencional
Existem 3 etapas que compreendem a reação de PCR:
- Desnaturação – O DNA gnômico contendo a sequência a ser amplificada é desnaturado. Ou seja, ocorre a separação da dupla fita de DNA.
- Anelamento ou Hibridização – os iniciadores ou primers se ligam a fita de DNA que se pretende amplificar. Um deles é complementar à sequência em uma fita da dupla-hélice de DNA e o outro é complementar à sequência na outra fita. São eles que irão identificar/marcar qual trecho de interesse do DNA deverá ser copiado.
- Extensão ou polimerização – com o ponto de partida já identificado, a Taq polimerase liga-se a fita sinalizada pelo primer, complementando-a. Inicia-se então a extensão do novo fragmento de DNA, formando novamente uma fita dupla de DNA.
Esse ciclo é realizado inúmeras vezes até atingir milhões de cópias. Na PCR convencional, a detecção do produto de amplificação normalmente é feita em eletroforese em gel de agarose. Após a coloração, ocorre a visualização do DNA pesquisado.
Processo de PCR convencional
qPCR – PCR em Tempo Real
Na qPCR, o resultado é visualizado imediatamente, dispensando a eletroforese. Isto é possível pela adição de sondas fluorescentes às reações de PCR. A amplificação do DNA-alvo é monitorada durante o processo de qPCR. A medida que o DNA é amplificado, o nível de fluorescência cresce proporcionalmente.
O equipamento é capaz de detectar a fluorescência eventualmente produzida pela amostra e assim a técnica permite acompanhar a reação e a apresentação dos resultados em tempo real.
Além disso, por meio do monitoramento da taxa de aumento da fluorescência na reação de PCR, é possível determinar com precisão a quantidade de DNA-alvo presente na amostra original. A qPCR pode ser utilizada para se avaliar a presença de um patógeno em uma amostra, podendo ser um teste qualitativo ou quantitativo.
Processo de PCR em Tempo Real (qPCR)
Leia mais: História e evolução da técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction)
Interferentes na técnica de qPCR
A elevada sensibilidade dessa técnica possibilita excelentes resultados, porém também está sujeita a presença de inibidores e contaminação que podem afetar a sua eficiência. Os plásticos para qPCR tem um grande impacto sobre os ensaios em tempo real e precisam receber um tratamento especial para não interferir na reação, principalmente na leitura do sinal fluorescente. Ocasionam assim um resultado errado, com baixa concentração ou mesmo inviabilizando o processo.
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Referências
MADIGAN, Michael T., MARTINKO, John M., BENDER, Kelly S., BUCKLEY, Daniel H., STAHL, David A. Microbiologia de Brock, 14ª edição . ArtMed, 2016.
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