Conheça a técnica de PCR, suas aplicações e princípios
Antes do desenvolvimento da PCR, Reação em Cadeia da Polimerase, os métodos utilizados para amplificar e gerar cópias de fragmentos de DNA eram demorados e trabalhosos. A PCR permite realizar várias cópias de um segmento específico de DNA com rapidez e precisão em um tempo muito menor.
A técnica é usada em diversos segmentos, desde experiências e procedimentos em biologia molecular e pesquisa à análise forense e diagnóstico médico.
A descoberta da estrutura do DNA, em 1953, pela dupla de pesquisadores Watson e Crick, levou a uma revolução científica admirável. Claro que esses pesquisadores não trabalharam sozinhos, e claro que isso foi, como toda descoberta científica, uma evolução de fatos, observações e ideias que culminou em um modelo comprovadamente correto. Aparentemente simples agora, essa revolução biotecnológica, criou um ramo totalmente novo na ciência – a biologia molecular.
A Reação em Cadeia da DNA Polimerase, mais conhecida pela sigla PCR, foi desenvolvida nos anos de 1980 e também revolucionou diversas áreas da biologia e da medicina. Essa técnica é utilizada para se obter a amplificação seletiva de determinada região de uma molécula de DNA, na qual apenas uma única molécula de DNA pode servir de molde para amplificação, produzindo milhares de cópias da molécula-alvo.
História e evolução da técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction ou Reação em Cadeia da Polimerase)
Como acontece a amplificação do DNA na técnica de PCR
O procedimento de PCR envolve três etapas, cada uma repetida muitas vezes.
1 – Desnaturação
O DNA genômico contendo a sequência a ser amplificada é desnaturado por aquecimento a cerca de 95°C por cerca de 30 segundos. A dupla fita é aberta (desnaturada), tornando-se uma fita única.
2 – Anelamento ou hibridização
Após a separação das fitas, um par de iniciadores ou primers (uma fita de DNA específica para o gene que se quer estudar) complementam a fita oposta da sequência de DNA a ser amplificada. Ou seja, um deles é complementar à sequência em uma fita da dupla-hélice de DNA e o outro é complementar à sequência na outra fita. O molde é determinado pela posição dos iniciadores que se anelam a fita. Essa etapa ocorre a uma temperatura de 60°C.
3 – Extensão ou polimerização
Com o molde já identificado, a enzima DNA-polimerase adiciona as bases complementares, formando uma nova fita e então tem-se novamente a duplicação da fita de DNA. Esse processo acontece a uma temperatura de 72°C.
Fonte: Bruces, ALBERTS,, JOHSON, Alexander, LEWIS, Julian, ROBERTS, Keith, WALTER, Peter, and RAFF, Martin. Biologia Molecular da Celula, 5ª edição. ArtMed, 2011. pág 545.
O ciclo inteiro é então reiniciado, os produtos do primeiro ciclo de replicação são então desnaturados, hibridizados e novamente replicados com DNA-polimerase. O procedimento é repetido muitas vezes até que o nível desejado de amplificação seja obtido.
Na prática, a amplificação efetiva do DNA requer de 20 a 30 ciclos de reação, com os produtos de cada ciclo servindo como DNA-molde para o próximo – dando origem ao termo “reação em cadeia” da polimerase.
Como cada etapa da reação ocorre em uma temperatura específica, a reação pode ser controlada. É utilizado um termociclador para determinar a temperatura e o tempo de cada etapa, bem como o número de ciclos de replicação.
A detecção do produto de amplificação normalmente é feita em eletroforese em gel de agarose, que é corado com brometo de etídio, permitindo a visualização direta do DNA pesquisado. Hoje, existem termocicladores que, além de amplificar o DNA, permitem a sua detecção – chamada PCR em tempo real (qPCR).
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Referências:
- M., XAVIER, Ricardo, DORA, José Miguel, SOUZA, Carolina Fischinger Moura de, and BARROS, Elvino.Laboratório na prática clínica: Consulta rápida, 2ª edição. ArtMed, 2011.
- Peter, SNUSTAD,, and SIMONS, Michael J..Fundamentos de Genética, 4ª edição. Guanabara Koogan, 2008.
- Bruces, ALBERTS,, JOHSON, Alexander, LEWIS, Julian, ROBERTS, Keith, WALTER, Peter, and RAFF, Martin.Biologia Molecular da Celula, 5ª edição. ArtMed, 2011.
- Gonçalves, PIMENTEL, Márcia Mattos, GALLO, Cláudia Vitória de Moura, and SANTOS-REBOUÇAS, Cíntia Barros.Genética Essencial. Guanabara Koogan, 2013.
