Os princípios da clonagem molecular: DNA recombinante

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A clonagem molecular é uma técnica da engenharia genética conhecida também por DNA recombinante, clonagem gênica ou manipulação gênica. Essa tecnologia permite pegar um “pedaço” do DNA e combiná-lo com outro, produzindo muitas cópias de diferentes combinações genéticas.

Quando usamos a palavra clonagem é muito comum realizar a associação com o clone de um organismo inteiro, como o caso da ovelha Dolly. Nos anos 90, os pesquisadores do Roslin Institute of Scotland anunciaram que haviam conseguido clonar com sucesso uma ovelha. O animal foi o primeiro mamífero clonado a partir de uma célula adulta e nasceu em 5 de julho de 1996.

Entretanto, clonar significa fazer uma cópia geneticamente exata, seja de um organismo completo ou até mesmo de um pequeno fragmento de DNA. É aqui que entra a clonagem molecular usada amplamente na ciência, medicina, agricultura e indústria.

Desde os anos 60 uma série de descobertas revolucionaram o estudo da genética e permitiram um grande desenvolvimento da engenharia genética. Desde então a utilização do DNA recombinante ganhou espaço e tem crescido absurdamente com inúmeras aplicações e aprimoramento das técnicas.

A clonagem molecular pode fazer com que genes estranhos sejam expressos em bactérias e leveduras ou mesmo em outras células superiores. As indústrias química, farmacêutica e agrária investem milhões em seu desenvolvimento. Esta tecnologia permite estudar os genes e os seus produtos, obter organismos transgênicos e realizar terapia gênica.

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Etapas da clonagem molecular

A clonagem molecular ou DNA recombinante é um método que permite fazer várias cópias idênticas (clones) de um pedaço específico de DNA. Para que isso ocorra é necessário realizar alguns passos que acompanharemos a seguir:

1. Isolar o gene de interesse

Primeiramente é necessário isolar o fragmento de DNA de interesse. Para que se tenha o DNA recombinante, de duas origens diferentes, é necessário utilizar as enzimas de restrição. Essas enzimas reconhecem a sequência alvo específica e cortam seletivamente o fragmento que será utilizado.

2. Unir o gene ao vetor: DNA recombinante

O fragmento de DNA é inserido em um vetor, que é uma molécula de DNA na qual um gene é inserido para construir a molécula de DNA recombinante. Geralmente os plasmídeos (moléculas de DNA circulares existentes naturalmente nas bactérias) são usados como vetores para clonar fragmentos de DNA. Eles são projetados para permitir a inserção de um DNA exógeno, têm origens de replicação e são capazes de se replicar independentemente do cromossomo bacteriano.

Assim, o fragmento do gene alvo se une ao vetor, através da DNA ligase, formando o plasmídeo recombinante contendo o gene de interesse. A DNA ligase é a responsável por selar as lacunas do eixo do DNA, funcionando como uma “cola”.

3.Transformação

A molécula de DNA recombinante produzida é introduzida em um organismo hospedeiro, podendo então ser replicadas. Esse processo é conhecido como transformação, no qual as células bacterianas captam o DNA do ambiente externo.

As células hospedeiras copiam o DNA do vetor juntamente com o próprio DNA, criando múltiplas cópias do DNA inserido. Alguns exemplos de células hospedeiras são as bactérias Escherichia coli e Bacillus subtilis e a levedura Saccharomyces cerevisiae.

Na prática, esse procedimento gera uma mistura de construções recombinantes. Algumas células contêm o gene clonado de interesse, ao passo que outras podem conter outros genes do DNA original.

Introdução do vetor no organismo e clonagem molecular

4. Seleção dos clones recombinantes

Para selecionar apenas as células de interesse o vetor possui um marcador selecionável que permite a identificação de moléculas recombinantes. Um marcador de antibiótico é frequentemente usado, assim uma célula hospedeira sem o vetor morre quando exposta a um determinado antibiótico, enquanto o hospedeiro com o vetor sobrevive e se multiplica, porque é resistente.

Seleção dos clones recombinantes

6. Multiplicação ou expressão do gene

Após as células com o plasmídeo recombinante serem identificadas, elas podem crescer em grande escala, replicando o fragmento de DNA. Nesse momento, damos às bactérias um sinal químico que as instrui a produzir a proteína alvo.

As bactérias servem como “mini fábricas”, produzindo grandes quantidades de proteína. Por exemplo, se nosso plasmídeo continha o gene da insulina humana, as bactérias começariam a transcrição do gene e a tradução do RNAm para produzir muitas moléculas da proteína insulina.

A proteína de interesse é então purificada, separada dos demais conteúdos das células, por exemplo, outras proteínas e macromoléculas. Isso garante que não haja nenhuma impureza, restando apenas o produto final, como no caso da insulina.

Multiplicação ou expressão do gene

Aplicação da clonagem de DNA

A clonagem molecular possui inúmeras aplicações e vem ganhando cada vez mais importância nos últimos anos. Entre as possibilidades estão o desenvolvimento de proteínas recombinantes mais seguras para o tratamento de doenças, o aprimoramento da terapia genética, a produção vacinas, além do uso na agricultura.

Veja abaixo algumas das aplicações da técnica de DNA recombinante:

Insulina – foi a primeira proteína humana produzida comercialmente utilizando bactérias modificadas por engenharia genética. Hoje outros hormônios e proteínas humanas estão sendo produzidos.
Plantas com inseticidas – Um uso pioneiro e economicamente importante é a engenharia genética de plantas que produzem seus próprios inseticidas. A bactéria Bacillus thuringiensisproduz naturalmente uma proteína, conhecida como toxina Bt, letal para muitos insetos. Essa toxina é particularmente atraente como inseticida porque é específica para alguns insetos, degradada rapidamente no ambiente e não tóxica para os humanos e outros animais.
Produção de leite – A somatotrofina bovina recombinante é amplamente usada nos Estados Unidos para aumentar a produção de leite no gado leiteiro.
Terapia genética – Em algumas desordens genéticas, os pacientes não possuem a forma funcional de um gene particular. A terapia genética tenta fornecer uma cópia normal do gene para as células do corpo do paciente. É utilizada no tratamento da fibrose cística.
Hormônio de crescimento humano – a administração deste hormônio durante a infância possibilita a correção da baixa estatura em casos correlacionados com a ausência ou pequena produção do hormônio do crescimento (GH).
Anticoagulantes – ativadores de plasminogênio tecidual ativam a plasmina, enzima que dissolve os trombos. Usado no tratamento de derrames, prevenção de coágulos sanguíneos e ataques cardíacos.