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Boas Práticas em PCR (Reação em cadeia da polimerase)

A técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction ou Reação em Cadeia da Polimerase) revolucionou a área médica e é utilizada para a identificação de várias doenças genéticas, infectocontagiosas e inclusive para realização de testes de paternidade e na ciência forense.

A PCR convencional e sua variação PCR em Tempo Real (qPCR) são técnicas muito sensíveis e específicas. Com a capacidade de amplificar o material genético, uma única molécula de DNA pode ser amplificada exponencialmente produzindo milhões de cópias de DNA. Esta reação utiliza sequências específicas do DNA, conhecidas como sequências alvo.

Mas apesar da sensibilidade da PCR ser o diferencial da técnica, também possibilita que interferências possam comprometer o resultado. A contaminação é uma preocupação frequente. As moléculas de DNA previamente amplificadas em outras reações (amplicons) são as que representam as maiores ameaças de contaminação. Por esse motivo, é imprescindível adotar práticas que assegurem sua eficiência e confiabilidade dos resultados, principalmente quando empregada para fins de diagnóstico.

Segundo RDC nº50/2002, o Laboratório de Biologia Molecular é classificado no Nível de Biossegurança 2 (NB-2), adequado para “qualquer trabalho que envolva sangue humano, líquidos corporais, tecidos ou linhas de células humanas primárias onde a presença de um agente infeccioso pode ser desconhecida”. As normas estabelecidas por essa resolução apontam as necessidades de infraestrutura física para laboratórios de Biologia Molecular.

A estrutura física adequada, o tipo de armazenamento, a manipulação da amostra e dos reagentes, o fluxo de trabalho, enfim todas as etapas aplicadas para a realização da PCR devem ser controladas e voltadas para minimizar as chances de contaminação.

Nesse artigo, você vai encontrar as Boas Práticas e estratégias direcionadas aos laboratórios de Biologia Molecular para o desenvolvimento de ensaios PCR com alto padrão de qualidade.

 

Leia também:

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10 Dicas da boa prática em PCR

 

1 – Salas dedicadas de Pré-PCR e Pós-PCR

 

A organização dos espaços físicos do laboratório pode minimizar o risco de contaminação. Portanto a separação física das salas de pré-PCR e pós-PCR deve ser realizada.

A sala de pré-PCR irá realizar a extração de DNA ou RNA e a manipulação dos reagentes. As áreas de preparação de amostras e reagentes poderão estar localizadas na mesma sala, desde que sejam respeitados os espaços definidos para cada uma delas.

Em uma condição ideal esses ambientes também podem ser exclusivos, sendo o laboratório estruturado com 3 salas dedicadas.

A sala de pós-PCR recebe apenas os produtos da reação. Devido a capacidade da PCR em amplificar pequenas quantidades do DNA molde, o menor traço de contaminação pode comprometer a reação toda. A exclusividade das salas pretende eliminar esse tipo de problema.

 

2 – Equipamentos e consumíveis

Assim como salas dedicadas é necessário utilizar os equipamentos e consumíveis específicos para pré ou pós-PCR de acordo com a designação da área. Assim uma pipeta que é utilizada na sala de pré-PCR, nunca será manipulada na sala de pós-PCR. Isso se aplica a outros objetos, como computadores, jalecos, telefones, cadernos de anotações etc.

 

3 – Fluxo de trabalho

A transferência dos itens deve estabelecer ainda um fluxo unidirecional, sempre da área de pré-PCR para a área pós-PCR, nunca o contrário. Logo um produto da pós-PCR, não poderá voltar para a primeira etapa.

Jalecos, luvas e outros equipamentos de proteção individual devem ser trocados antes de entrar em cada sala. Muitos laboratórios definem funcionários exclusivos para cada etapa, evitando a circulação entre as áreas.

 

4 – Preparação dos reagentes

A preparação de reagentes deve ocorrer em uma capela de fluxo laminar, preferencialmente equipada com uma luz UV. Isso evita a contaminação cruzada das amostras. As paredes da capela devem ser limpas antes do preparo dos reagentes.

 

5 – Rotina de limpeza

Os equipamentos, instrumentos e bancadas devem ter uma rotina de limpeza. Geralmente se utiliza hipoclorito e álcool 70% para todos os materiais antes e depois dos ensaios. Essa é uma abordagem simples, mas muitas vezes negligenciada pela equipe de laboratório. A limpeza constante da área de trabalho pode evitar a contaminação e assegurar uma PCR com resultado de qualidade.

 

6 – Identificação da amostra

É fundamental que as amostras sejam registradas com um código de identificação que as acompanhará em todas as fases da análise. A identificação é única e exclusiva para cada indivíduo, independente de quantas amostras fora colhidas. O conteúdo do formulário para essa identificação varia para cada laboratório, mas deve conter o máximo de informações possíveis.

 

7 – Uso de controles positivos e negativos

Utilizar o controle positivo e controle interno é essencial para minimizar possíveis erros técnicos, contaminações que venham acontecer, detectar resultados falso negativos e falso positivos.

O controle negativo é importante durante as reações de amplificação. Se apresentar um resultado positivo, o ensaio deve ser repetido. Se o resultado positivo se mantiver, é um indicador de uma contaminação geral do laboratório ou de má qualidade dos materiais utilizados.

 

8 – Pipetagem

É comum a utilização de volumes muito variados nas reações e, desta forma, o manuseio de micropipetas e pipetas de diferentes capacidades são necessárias. O uso correto do equipamento, usar ponteiras com filtros, a calibração para evitar que o líquido ultrapasse e vaze são pontos fundamentais para evitar a contaminação da amostra.

 

9 – Uso de EPI – Equipamento de Proteção Individual

Laboratórios são ambientes de contato direto com agentes biológicos, físicos, químicos, calor ou frio excessivo entre outros riscos que podem comprometer a saúde do profissional. Por isso, o uso de equipamentos de proteção individual é de fundamental importância.  Os de uso mais comuns são: jaleco, luvas, máscaras e óculos. Mas cada situação deve ser avaliada com atenção para determinar qual o melhor equipamento para tal procedimento.

 

10 – Prevenção de Riscos

É o conjunto de ações que vão desde a organização do trabalho, segurança nas atividades laboratoriais, higiene e conforto, que tem como objetivo proporcionar o funcionamento correto e  a diminuição dos riscos e contaminações no ambiente laboratorial:

  • Manter a organização na bancada
  • Manipulação de amostras sob condições estéreis e protegidas do operador
  • Os equipamentos e instrumentos devem ter uma rotina de limpeza, manutenção e calibração
  • Materiais biológicos, reagentes, organismos geneticamente modificados e resíduos requerem cuidados no manuseio e no descarte.
  • Correta identificação, armazenamento a manuseio de reagentes
  • Antes de iniciar o experimento verifique se todas as conexões e ligações estão seguras
  • O uso de luvas de proteção para manipulação de materiais biológicos e químicos não substitui a lavagem correta das mãos
  • Descontaminação do laboratório e equipamento

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Referências:

Guia de Boas Práticas Laboratoriais em Citogenética e Genética Molecular Humana, Cleide Largman Borovik.

Guia de Boas Práticas Laboratoriais, Hospital das Clínicas – FMUSP.

Biossegurança em Laboratórios de Análises Clínicas, Caroline dos Santos da Fonseca.

Good Laboratory Practice when Performing Molecular Amplification Assays, Public Health England.